Michèle Lea Kovacs
Bachelor Thesis
Produktionssystemwechsel zur Expression der Cellulase CelA aus Neocallimastix
patriciarum von E. coli zu P. pastoris und S. cerevisiae
Die effiziente Nutzung lignocelluloser Biomasse zur Energiegewinnung erfordert leistungsfähige Enzyme für den Abbau pflanzlicher Zellwände. CelA, eine Cellobiohydrolase aus dem anaeroben Pilz Neocallimastix patriciarum, zeigt hohe Prozessivität gegenüber Cellulose und ist damit ein vielversprechendes Werkzeug für Biogasanwendungen. Ziel dieser
Arbeit war es, das CelA-Gen aus einem bakteriellen Expressionssystem (E. coli) in die eukaryotischen Wirte Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu übertragen, um die funktionelle Expression in Hefe zu ermöglichen. Hierfür wurde CelA zunächst in die Expressionsvektoren pYES2 (S. cerevisiae) und pPICZα-A (P. pastoris) kloniert. Nach der erfolgreichen Transformation in E. coli NEB 10-beta konnte
die Insertpräsenz durch Sequenzierung bestätigt werden. Die Transformation von S. cerevisiae mit pYES2_CelA führte zu Kolonien auf Uracil-selektivem Medium, was die Aufnahme des Plasmids belegte. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigte jedoch kein eindeutig sichtbares Proteinband in der erwarteten Grösse (~53 kDa), während der DNS-Assay eine
exponentielle Zunahme der Enzymaktivität von ca. 0.6 U/mL auf 3.2 U/mL innerhalb von 8 h Induktion dokumentierte. Dies deutet auf eine funktionelle Expression des CelA-Enzyms in S. cerevisiae hin. Im Gegensatz dazu blieb die Transformation von P. pastoris mit dem linearisierten pPICZα- A_CelA-Plasmid ohne Erfolg, vermutlich aufgrund einer zu geringen Menge linearer DNA. Zusätzlich wurden Stabilitätstests des in E. coli exprimierten CelA durchgeführt, die zeigten, dass das Enzym bei 4 °C wie auch bei –20 °C über mindestens fünf Wochen weitgehend aktiv bleibt, während es bei –20 °C niedrigere Aktivität aufwies. Die Ergebnisse belegen, dass S. cerevisiae prinzipiell als Produktionssystem für funktionelles CelA geeignet ist, während für P. pastoris eine Optimierung der DNA-Aufbereitung notwendig
ist. Die Arbeit liefert damit eine Grundlage für die weitere Entwicklung eukaryotischer Expressionssysteme zur Bereitstellung von CelA für biotechnologische Anwendungen, etwa zur Verbesserung des Aufschlusses von Cellulose in Biogasanlagen.